除了两位水管工兄弟,游戏中的经典角色也在电影中亮相。碧姬公主作为蘑菇王国意志坚定的统治者,在片中对马力欧进行了严酷的作战训练,以帮助后者挖掘自身潜力。喜剧演员杰克·布莱克、塞斯·罗根则为片中的大反派酷霸,以及“搞笑担当”大猩猩咚奇刚配音。值得一提的还有,为游戏中的马力欧和路易吉兄弟配音长达三十余年的查尔斯·马丁内斯,也在片中友情客串。事实上,“刘三姐”的选角首选,并非黄婉秋。导演苏里在40余位演员中反复挑选几位候选人之后,始终觉得少了点什么。思来想去,他还是觉得这个角色要由地道的“广西女孩”扮演,于是,他选择了本扮演“舟妹”的黄婉秋,来出演“刘三姐”。